Laboratorium Biokrystalografii

Laboratorium jest wyposażone kompleksowo w aparaturę umożliwiającą otrzymywanie monokryształów biomolekuł (np. białek), syntezę kompleksów białek z małymi cząsteczkami biologicznie aktywnymi oraz badania strukturalne tych układów na poziomie molekularnym za pomocą dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego. Laboratorium badań bio-krystalograficznych jest pierwszym laboratorium w środowisku uczelni i instytutów badawczych w Lublinie.

Pełne badania mechanizmów aktywności biologicznej związków wymagają wiedzy o strukturze cząsteczek na poziomie atomowym, po to aby było możliwe dokonanie korelacji SAR (structure-activity relationship). Jednoznaczne informacje o budowie cząsteczek - zarówno „małych” jak i makromolekuł - można uzyskać, stosując metody dyfrakcji na monokryształach. Najpowszechniej stosowaną eksperymentalną techniką dyfrakcyjną jest rentgenowska analiza strukturalna.

Planowane badania:

Identyfikacja miejsc wiążących białek receptorowych, szczególnie substancji o nietypowym mechanizmie działania – modulatorów allosterycznych, modulatorów dualsterycznych, związków o działaniu wielokierunkowym i chimer. Wyniki mogą pomóc w odkryciu nowych, innowacyjnych leków w leczeniu bólu, depresji, uzależnień i innych schorzeń oun a także chorób nowotworowych. Dodatkowo współkrystalizacja ligandów z białkami receptorowymi pozwoli na badanie mechanizmów sensytyzacji i desensytyzacji białek oraz homo- i hetero-oligomeryzacji. Badania tego typu są nowatorskie w Polsce i na najwyższym światowym poziomie.
Wykonanie tych badań jest możliwe dzięki unikalnej aparaturze.

Wyposażenie laboratorium:

A. Zestaw do dyfrakcyjnych badań monokryształów składający się z dyfraktometru firmy Rigaku XtaLAB, ze źródłem promieniowania rentgenowskiego wysokiej jasności MicroMax-007 HF i detektora powierzchniowego Pilatus do zastosowań w krystalografii białek oraz z układem chłodzenia kryształu firmy Oxford Cryosystems Cryostream 800.

Aby można było badać najmniejsze i słabo rozpraszające kryształy białek, zastosowany jest generator rentgenowski typu ‘microfocus’ z rotującą anodą lampy, z wiązką elektronów na anodzie o średnicy ≤ 75 µm. To, w połączeniu z optyką monochromatyzująco-ogniskującą, umożliwia osiągnięcie wysokiej jasności promieni Cu Kα na krysztale (jasność źródła w miejscu próbki jest równa co najmniej 3.4  109 photons/sec/mm2/mrad2).
Drugi kluczowy element dyfraktometru to detektor promieniowania rentgenowskiego wykonany w technologii HPAD (hybrid pixel array detector), łączący zliczanie pojedynczych fotonów i technologię hybrydowo-pikselową, pozwalający na bezpośrednią detekcję fotonów X. Pole aktywne detektora ma wymiar około 80 x 70 mm², aby uzyskiwać zwiększoną rozdzielczość. Czas odczytu z detektora jest krótszy niż 8 msek przy pełnej rozdzielczości, co minimalizuje całkowity czas pomiaru.

Dyfraktometr jest wyposażony w system oprogramowania HKL-3000R do kontroli aparatu, zbierania, integracji i analizy danych. W laboratorium zainstalowany jest też pakiet programów CrysAlisPRO.

Dyfraktometry rentgenowskie serii XtaLAB mają zastosowanie do badań szerokiego zakresu próbek krystalicznych, od małych cząsteczek, poprzez sieci metaloorganiczne, do makromolekuł biologicznych. Kluczowym elementem składowym tej serii jest detektor typu HPAD (hybrid pixel array detector). Technologia HPAD daje niemal doskonały detector i znacznie rozszerza możliwości dyfraktometrów monokrystalicznych zarówno pod względem szybkości zbierania danych jak i bardziej precyzyjnego pomiaru słabych danych dyfrakcyjnych. System XtaLAB wyposażony jest w generator MicroMax-007 HF, który jest generatorem drugiej generacji, z obracaną anodą i prawdziwym mikro-ogniskowaniem wiązki elektronów. W połączeniu z optyką VariMax, unikalnie mała wiązka elektronów na anodzie daje intensywną monochromatyczną wiązkę promieni Rentgena na próbce, która umożliwia optymalizację poziomu sygnału do szumu dla małych kryształów białka stosowanych obecnie w laboratoriach badawczych

Generator z obracaną anodą o bezpośrednim napędzie MicroMax-007HF typu microfocus
  • - obciążenie 1200 W,
  • - miedziana anoda z napędem bezpośrednim,
  • - średnica ogniskowa około 70 mikronów
  • - dwie migawki obrotowe o dużej szybkości
Optymalna wydajność dyfrakcji dla próbek o wymiarach 300 mikronów lub mniejszych.

Ogniskujący system optyki rentgenowskiej VariMaxTM-HF zapewnia maksymalną jasność wiązki i posiada regulowane ustawienie dywergencji, umożliwiające regulację średnicy wiązki w zależności od stałych sieciowych kryształu.

System obejmuje:
  • - optykę Osmic VariMax High Flux z obudową,
  • - translator optyczny (2 osie obrotu, 3 osie przesuwu z ręczną regulacją, szczeliny do ustawiania dywergencji),
  • - zestaw łączący optykę z oknem migawki,
  • - obudowę próżniową w celu ochrony optyki i zmniejszenia rozpraszana wiązki przez powietrze.
Detektor PILATUS 200K 2D jest zbudowany z użyciem technologii typu HPAD, która łączy pikselowane czujniki krzemowe z elektronicznymi układami odczytu typu CMOS. Jest stosowany w najbardziej wymagających badaniach krystalograficznych przy użyciu promieni rentgenowskich. Główne cechy tego detektora to:
  • powierzchnia aktywna 83.8  70.0 mm2,
  • bezpośrednie wykrywanie promieni rentgenowskich przez zliczanie pojedynczych fotonów,
  • duży zakres dynamiki (> 1,000,000:1 na piksel),
  • krótki czas odczytu (7 msek), wysoka częstotliwość obrazów, duża szybkość zliczania,
  • brak szumów tła i odczytu i doskonała rozdzielczość pikseli (point-spread function).
Pilatus 200 ma niewielkie rozmiary, jest łatwy w użyciu i jest chłodzony powietrzem, co zapewnia niewielkie wymagania eksploatacyjne.

Goniometr 4-kołowy AFC11 Partial-chi umożliwia ruchy wokół osi ϕ, ω, , 2θ oraz regulowaną odległość pomiędzy próbką a detektorem.

Zalety tego goniometru 4-kołowego to:
  • automatyczna zmiana odległości od próbki do detektora: 27 do 287 mm
  • maksymalny dostęp do sfery Ewalda dający dobrą kompletność pomiaru, także dla kryształów o niskiej symetrii.
  • zastosowanie ruchów obrotowych pod różnymi kątami umożliwia ekonomiczne strategie zbierania danych w jak najkrótszym czasie.

Cryostream 800 to przystawka temperaturowa (urządzenie jest zasilane ciekłym azotem jako czynnikiem chłodzącym), umożliwiająca przeprowadzanie eksperymentów w zakresie temperatur 80 – 300 K.

B. Mikroskop polaryzacyjny Nikon Eclipse LV100ND metallographic jest wyposażeniem dodatkowym, niezbędnym do oceny procesów krystalizacji i montowania preparatów do badań dyfrakcyjnych. Mikroskop metalograficzny z polaryzacją służy do wizualnej obserwacji w świetle przechodzącym i odbitym; posiada trinokularową nasadkę obserwacyjną. Pozwala też na wykonywanie zdjęć próbek bezpośrednio na płytce do krystalizacji, co umożliwia szybki wybór preparatów i optymalizację warunków krystalizacji.

C. Termostatowane pomieszczenie, w którym przygotowywane są układy do krystalizacji białek i prowadzone są procesy krystalizacji.

 

 

Opracowanie: Anna Kozioł, Dariusz Matosiuk, Oleksandra Savchenko