OPUS NCN 2012-2016

Od 08.11.2012 do 07.05.2016, w Zakładzie Genetyki i Mikrobiologii Wydziału Biologii i Biotechnologii UMCS, pod kierownictwem prof. dr hab. Wandy Małek i przy udziale dr Sebastiana Gnata, dr Sylwii Wdowiak-Wróbel, dr Michała Kality, dr hab. Barbary Łotockiej realizowany był projekt badawczy OPUS, finansowany przez NCN, pt. „Pozycja taksonomiczna i filogeneza mikrosymbiontów Astragalus glycyphyllos oparta na charakterystyce fenotypowej, analizie sekwencji genów rdzeniowych i adaptacyjnych bakterii”.

            Przeprowadzone w ramach grantu wielokierunkowe badania symbiontów dziko rosnącej rośliny bobowatej Astragalus glycyphyllos (traganek szerokolistny), które dotychczas nie były opisane w literaturze naukowej przez innych autorów, pozwoliły określić ich pozycję gatunkową i rodzajową, historię ewolucyjną genów rdzeniowych i symbiotycznych, zakres gospodarza, efektywność wiązania azotu atmosferycznego oraz strukturę brodawek indukowanych przez ryzobia na korzeniach traganka szerokolistnego.

            Na podstawie analizy numerycznej cech fenotypowych badanych bakterii i referencyjnych ryzobiów, reprezentujących różne ich gatunki i rodzaje, symbionty traganka szerokolistnego zostały wstępnie zaklasyfikowane do rodzaju Mesorhizobium. Duża różnorodność fenotypowa tych bakterii to ważny atrybut w ich przeżywaniu w zmiennych warunkach glebowych.

            Współczesną taksonomię bakterii zdominowały molekularne techniki analizy genomu. Zróżnicowanie  genomowe izolatów z brodawek A. glycyphyllos i ich pokrewieństwo genomowe analizowano trzema metodami opartymi na technice PCR, tj. RAPD, ERIC-PCR i AFLP. Grupowanie symbiontów A. glycyphyllos w oparciu o profile DNA uzyskane wspomnianymi metodami „odcisków” genomów i metodą RFLP-16S rDNA generalnie było podobne, co nie tylko potwierdza potencjał metod:  RAPD, ERIC-PCR i AFLP w analizie polimorfizmu genomowego symbiontów traganka szerokolistnego, ale i w analizie ich pokrewieństwa ewolucyjnego.

            Porównawcza analiza sekwencji 16S rDNA jest szeroko stosowana w określaniu pozycji rodzajowej bakterii (zgodnie z zasadą, że rodzaj obejmuje szczepy o przynajmniej 95% stopniu podobieństwa sekwencji 16S rDNA) i w śledzeniu ich historii ewolucyjnej. Wyniki analizy niemal pełnej sekwencji 16S rDNA (1,239 pz) symbiontów traganka szerokolistnego, reprezentujących różne fenony i grupy genomowe, potwierdziły wyniki numerycznej analizy cech fenotypowych. Na filogramie genu 16S rRNA symbionty A. glycyphyllos utworzyły wspólną grupę z bakteriami rodzaju Mesorhizobium dzieląc z tymi bakteriami od 95 do 99% identycznych sekwencji 16S rDNA co pozwoliło sklasyfikować symbionty traganka szerokolistnego do rodzaju Mesorhizobium.

            Cechą genomową szeroko stosowaną w taksonomii bakterii jest zawartość zasad G+C w DNA wyrażona w mol%. Analiza zawartości zasad G+C  w DNA (oparta na metodzie HPLC) potwierdziła klasyfikację symbiontów A. glycyphyllos do rodzaju Mesorhizobium. Zawartość zasad G+C w genomowym DNA badanych bakterii wyniosła 59.4-62.1 mol%, a więc w zakresie charakterystycznym dla bakterii rodzaju Mesorhizobium.

            Filogenetyczna analiza bakterii oparta na sekwencji 16S rDNA ma pewne ograniczenia wynikające z możliwości występowania w genomie tych organizmów do kilkunastu kopii operonów rRNA jak i z możliwości horyzontalnego transferu 16S rDNA. Wykorzystanie w badaniu filogenezy bakterii pięciu genów metabolizmu podstawowego o większym poziomie informatyczności niż 16S rDNA, pozwala  definitywnie ustalić ich pozycję rodzajową, a łączna analiza sekwencji tych genów (MLSA) pozwala także określić pozycję gatunkową bakterii. Na filogramie połączonych sekwencji genów: atpD, dnaK, glnA, recA, rpoB (3,030 pz) symbionty A. glycyphyllos zgrupowały się z bakteriami rodzaju Mesorhizobium i utworzyły z nimi monofiletyczną grupę o podobieństwie sekwencji 92-97%. Izolaty z brodawek traganka szerokolistnego zgrupowały się w dwóch odrębnych podgrupach, tj. część utworzyła wspólne grono z bakteriami gatunku M. ciceri wskazując na ich przynależność do tego taksonu, a część z bakteriami  M. amorphae i M. septentrionale,co nie pozwoliło definitywnie przydzielić badane ryzobia do gatunku. Pozycja gatunkowa symbiontów A. glycyphyllos  została ostatecznie określona w oparciu o stopień hybrydyzacji DNA-DNA zgodnie z zasadą, że ≥70% stopień reasocjacji DNA-DNA stanowi granicę wyznaczającą gatunek. Wykorzystując hybrydyzację DNA-DNA potwierdzono przynależność części badanych szczepów do gatunku M. ciceri (stopień hybrydyzacji DNA-DNA 76.4-84.2% ), a część izolatów z brodawek korzeniowych traganka szerokolistnego sklasyfikowano do gatunku M. amorphae (stopień hybrydyzacji DNA-DNA 77.5-80.1%).

            Obecnie taksonomia bakterii brodawkowych nie jest oparta na zakresie gospodarza roślinnego, ale taki marker jest wymagany przy opisie nowego gatunku. Mutualistyczna interakcja ryzobium-roślina bobowata determinowana jest przez geny nod (nodulation – brodawkowanie),niezbędne w syntezie czynników Nod, które uczestniczą w tworzeniu brodawek korzeniowych oraz przez geny nif kodujące kompleks nitrogenazy odpowiedzialny za wiązanie N₂. Na filogramach dwóch, tzw. genów wspólnych nod (nodA i nodC), genu specyficzności gospodarza nodH i genu reduktazy nitrogenazy nifH symbionty A. glycyphyllos (sklasyfikowane do dwóch gatunków, tj.  M. amorphae i  M. ciceri) utworzyły jedną, wyraźnie odrębną grupę co sugeruje wspólne pochodzenie genów symbiotycznych i ich horyzontalny transfer od wspólnego przodka do badanych bakterii. Dodatkowo, na podstawie analizy sekwencji genów nodA i nodC i filogramów tych genów izolaty z brodawek traganka szerokolistnego zostały skalsyfikowane do nowego symbiowaru „glycyphyllae”, który odzwierciedla symbiotyczny fenotyp (ekotyp) tych bakterii.

            Symbioza ryzobiów z roślinami bobowatymi jest gatunkowo specyficznym procesem i każdy mikrosymbiont tworzy brodawki tylko na określonych gospodarzach. W oparciu o roślinne testy szczepienne, symbionty A. glycyphyllos sklasyfikowano do ryzobiów o wąskim zakresie gospodarza. Wykazano również ich wysoką efektywność wiązania N₂, ważną dla obu partnerów symbiotycznej interakcji i dla naturalnego środowiska.

            Wyróżnia się dwa główne rodzaje brodawek korzeniowych u roślin bobowatych, które są indukowane przez ryzobia, tj. określone i nieokreślone różniące się morfologią, rozwojem i fizjologią.           Na podstawie struktury brodawek w mikroskopie świetlnym i transmisyjnym mikroskopie elektronowym, brodawki korzeniowe A. glycyphyllos zdefiniowano jako nieokreślone z apikalnym trwałym merystemem, gradientem rozwoju tkanki bakteroidalnej i wiązką przewodzącą w korteksie.

Publikacje powstałe w wyniku realizacji powyższego projektu:

1. Gnat S., Wójcik M., Wdowiak-Wróbel S., Kalita M., Ptaszyńska A., Małek W. (2014) Phenotypic characterization of Astragalus glycyphyllos symbionts and their phylogeny based on the 16S rDNA sequences and RFLP of 16S rRNA gene. Antonie van Leeuwenhoek, 105, 1033-1048.
2. Gnat S., Małek W., Oleńska E., Trościańczyk A., Wdowiak-Wróbel S., Kalita M., Wójcik M. (2015) Insight into the genomic diversity and relationship of Astragalus
   glycyphyllos symbionts by RAPD, ERIC-PCR, and AFLP fingerprinting. J Appl Genetics. DOI 10.1007/s13353-015-0285-6.Journal of Applied Genetics: Volume 56, Issue 4 (2015), Page 551-554
3. Gnat S., Małek W., OleńskaE., Wdowiak-Wróbel S., Kalita M., Łotocka B., Wójcik M. (2015) Phylogeny of Symbiotic Genes and the Symbiotic Properties of Rhizobia Specific to Astragalus glycyphyllos L. PLOS ONE, DOI:10.1371/journal.pone.0141504, October 23,2015, 1-18.
4. 4.      Gnat S., Małek W., Oleńska E., Wdowiak-Wróbel S., Kalita M., Rogalski J., Wójcik
    M. 2016 Multilocus sequence analysis supports taxonomic position of Astragalus
    glycyphyllos symbionts based on DNA-DNA hybridization. International Journal of
    Systematic and Evolutionary Microbiology, 66(4):1906-12. doi:
    10.1099/ijsem.0.000862.