Od 08.11.2012 do 07.05.2016, w Zakładzie Genetyki i Mikrobiologii Wydziału Biologii i Biotechnologii UMCS, pod kierownictwem prof. dr hab. Wandy Małek i przy udziale dr Sebastiana Gnata, dr Sylwii Wdowiak-Wróbel, dr Michała Kality, dr hab. Barbary Łotockiej realizowany był projekt badawczy OPUS, finansowany przez NCN, pt. „Pozycja taksonomiczna i filogeneza mikrosymbiontów Astragalus glycyphyllos oparta na charakterystyce fenotypowej, analizie sekwencji genów rdzeniowych i adaptacyjnych bakterii”.
Przeprowadzone w ramach grantu wielokierunkowe badania symbiontów dziko rosnącej rośliny bobowatej Astragalus glycyphyllos (traganek szerokolistny), które dotychczas nie były opisane w literaturze naukowej przez innych autorów, pozwoliły określić ich pozycję gatunkową i rodzajową, historię ewolucyjną genów rdzeniowych i symbiotycznych, zakres gospodarza, efektywność wiązania azotu atmosferycznego oraz strukturę brodawek indukowanych przez ryzobia na korzeniach traganka szerokolistnego.
Na podstawie analizy numerycznej cech fenotypowych badanych bakterii i referencyjnych ryzobiów, reprezentujących różne ich gatunki i rodzaje, symbionty traganka szerokolistnego zostały wstępnie zaklasyfikowane do rodzaju Mesorhizobium. Duża różnorodność fenotypowa tych bakterii to ważny atrybut w ich przeżywaniu w zmiennych warunkach glebowych.
Współczesną taksonomię bakterii zdominowały molekularne techniki analizy genomu. Zróżnicowanie genomowe izolatów z brodawek A. glycyphyllos i ich pokrewieństwo genomowe analizowano trzema metodami opartymi na technice PCR, tj. RAPD, ERIC-PCR i AFLP. Grupowanie symbiontów A. glycyphyllos w oparciu o profile DNA uzyskane wspomnianymi metodami „odcisków” genomów i metodą RFLP-16S rDNA generalnie było podobne, co nie tylko potwierdza potencjał metod: RAPD, ERIC-PCR i AFLP w analizie polimorfizmu genomowego symbiontów traganka szerokolistnego, ale i w analizie ich pokrewieństwa ewolucyjnego.
Porównawcza analiza sekwencji 16S rDNA jest szeroko stosowana w określaniu pozycji rodzajowej bakterii (zgodnie z zasadą, że rodzaj obejmuje szczepy o przynajmniej 95% stopniu podobieństwa sekwencji 16S rDNA) i w śledzeniu ich historii ewolucyjnej. Wyniki analizy niemal pełnej sekwencji 16S rDNA (1,239 pz) symbiontów traganka szerokolistnego, reprezentujących różne fenony i grupy genomowe, potwierdziły wyniki numerycznej analizy cech fenotypowych. Na filogramie genu 16S rRNA symbionty A. glycyphyllos utworzyły wspólną grupę z bakteriami rodzaju Mesorhizobium dzieląc z tymi bakteriami od 95 do 99% identycznych sekwencji 16S rDNA co pozwoliło sklasyfikować symbionty traganka szerokolistnego do rodzaju Mesorhizobium.
Cechą genomową szeroko stosowaną w taksonomii bakterii jest zawartość zasad G+C w DNA wyrażona w mol%. Analiza zawartości zasad G+C w DNA (oparta na metodzie HPLC) potwierdziła klasyfikację symbiontów A. glycyphyllos do rodzaju Mesorhizobium. Zawartość zasad G+C w genomowym DNA badanych bakterii wyniosła 59.4-62.1 mol%, a więc w zakresie charakterystycznym dla bakterii rodzaju Mesorhizobium.
Filogenetyczna analiza bakterii oparta na sekwencji 16S rDNA ma pewne ograniczenia wynikające z możliwości występowania w genomie tych organizmów do kilkunastu kopii operonów rRNA jak i z możliwości horyzontalnego transferu 16S rDNA. Wykorzystanie w badaniu filogenezy bakterii pięciu genów metabolizmu podstawowego o większym poziomie informatyczności niż 16S rDNA, pozwala definitywnie ustalić ich pozycję rodzajową, a łączna analiza sekwencji tych genów (MLSA) pozwala także określić pozycję gatunkową bakterii. Na filogramie połączonych sekwencji genów: atpD, dnaK, glnA, recA, rpoB (3,030 pz) symbionty A. glycyphyllos zgrupowały się z bakteriami rodzaju Mesorhizobium i utworzyły z nimi monofiletyczną grupę o podobieństwie sekwencji 92-97%. Izolaty z brodawek traganka szerokolistnego zgrupowały się w dwóch odrębnych podgrupach, tj. część utworzyła wspólne grono z bakteriami gatunku M. ciceri wskazując na ich przynależność do tego taksonu, a część z bakteriami M. amorphae i M. septentrionale,co nie pozwoliło definitywnie przydzielić badane ryzobia do gatunku. Pozycja gatunkowa symbiontów A. glycyphyllos została ostatecznie określona w oparciu o stopień hybrydyzacji DNA-DNA zgodnie z zasadą, że ≥70% stopień reasocjacji DNA-DNA stanowi granicę wyznaczającą gatunek. Wykorzystując hybrydyzację DNA-DNA potwierdzono przynależność części badanych szczepów do gatunku M. ciceri (stopień hybrydyzacji DNA-DNA 76.4-84.2% ), a część izolatów z brodawek korzeniowych traganka szerokolistnego sklasyfikowano do gatunku M. amorphae (stopień hybrydyzacji DNA-DNA 77.5-80.1%).
Obecnie taksonomia bakterii brodawkowych nie jest oparta na zakresie gospodarza roślinnego, ale taki marker jest wymagany przy opisie nowego gatunku. Mutualistyczna interakcja ryzobium-roślina bobowata determinowana jest przez geny nod (nodulation – brodawkowanie),niezbędne w syntezie czynników Nod, które uczestniczą w tworzeniu brodawek korzeniowych oraz przez geny nif kodujące kompleks nitrogenazy odpowiedzialny za wiązanie N2. Na filogramach dwóch, tzw. genów wspólnych nod (nodA i nodC), genu specyficzności gospodarza nodH i genu reduktazy nitrogenazy nifH symbionty A. glycyphyllos (sklasyfikowane do dwóch gatunków, tj. M. amorphae i M. ciceri) utworzyły jedną, wyraźnie odrębną grupę co sugeruje wspólne pochodzenie genów symbiotycznych i ich horyzontalny transfer od wspólnego przodka do badanych bakterii. Dodatkowo, na podstawie analizy sekwencji genów nodA i nodC i filogramów tych genów izolaty z brodawek traganka szerokolistnego zostały skalsyfikowane do nowego symbiowaru „glycyphyllae”, który odzwierciedla symbiotyczny fenotyp (ekotyp) tych bakterii.
Symbioza ryzobiów z roślinami bobowatymi jest gatunkowo specyficznym procesem i każdy mikrosymbiont tworzy brodawki tylko na określonych gospodarzach. W oparciu o roślinne testy szczepienne, symbionty A. glycyphyllos sklasyfikowano do ryzobiów o wąskim zakresie gospodarza. Wykazano również ich wysoką efektywność wiązania N2, ważną dla obu partnerów symbiotycznej interakcji i dla naturalnego środowiska.
Wyróżnia się dwa główne rodzaje brodawek korzeniowych u roślin bobowatych, które są indukowane przez ryzobia, tj. określone i nieokreślone różniące się morfologią, rozwojem i fizjologią. Na podstawie struktury brodawek w mikroskopie świetlnym i transmisyjnym mikroskopie elektronowym, brodawki korzeniowe A. glycyphyllos zdefiniowano jako nieokreślone z apikalnym trwałym merystemem, gradientem rozwoju tkanki bakteroidalnej i wiązką przewodzącą w korteksie.
Publikacje powstałe w wyniku realizacji powyższego projektu: